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10.2.4. El sentido de crecimiento de las nuevas hebras

La síntesis de ADN in vitro

Kornberg, discípulo del bioquímico Severo Ochoa, estudió en 1956 cómo se sintetizaba una nueva cadena complementaria de ADN a partir de otra cadena, y qué enzima regulaba la replicación. Aisló la enzima ADN-polimerasa a partir de la bacteria Escherichia coli, y comprobó es capaz de sintetizar ADN in vitro.

La ADN-polimerasa necesita desoxirribonucleótidos-5-trifosfatos de adenina, timina, guanina y citosina, iones magnesio Mg2+, y que una de las cadenas de la molécula de ADN haga de “patrón”, y que un extremo de la otra actúe como “cebador”.

La ADN-polimerasa es una enzima formada por unos 1000 aminoácidos, y se localiza en el núcleo y en las mitocondrias. A esta enzima se une el ADN patrón, el ADN cebador, y el nucleótido que se va a añadir. Puede sintetizar in vitro (no en una célula viva) ADN a partir de ADN natural.

La ADN-polimerasa no puede comenzar la síntesis de una cadena, sino que únicamente puede añadir nucleótidos al extremo de una cadena preexistente, el ADN cebador. Sólo añade los nucleótidos en el extremo de la cadena que presenta libre el carbono 3’ del nucleótido.

De este modo, la cadena que comienza con el ADN cebador, sólo crece en el sentido 5'→3'. Así, el nucleótido que tiene su carbono 5' libre es el primer nucleótido de la cadena de ADN y el nucleótido que tiene libre el carbono 3' es el último nucleótido que se ha añadido a la cadena, y al que se puede añadir otro.

La nueva cadena sintetizada es antiparalela y complementaria.

El problema de la dirección en la duplicación del ADN in vivo

Cairns, en 1963, realizó uno de los primeros experimentos que trataban de observar cómo se desarrollaba la replicación del ADN.

Introdujo bacterias Escherichia coli en un medio con timina marcada con tritio (H3), es decir, una timina que en vez de hidrógeno tenía tritio. El tritio es un isótopo radiactivo que emite partículas beta (β), capaces de impresionar una placa fotográfica, lo que permite localizar las nuevas moléculas de ADN que se han sintetizado.

Cada pocos minutos se comprobaba la cantidad de timina (con H3) que contenía el ADN bacteriano, obteniéndose una secuencia de imágenes con la duplicación completa del ADN.

  • Las primeras imágenes tenían forma de V, las siguientes de medias lunas, y las últimas parecían círculos más o menos aplastados.
  • Las formas en V son las horquillas de replicación, formadas por las dos nuevas cadenas de ADN (con H3) que se sintetizan sobre las cadenas de ADN que se han abierto para hacer de moldes.
  • Las formas en media luna corresponden a las burbujas de replicación.
  • Las formas circulares permitieron descubrir que el ADN de la bacteria Escherichia coli era circular.
  • Con este experimento, además de confirmar la hipótesis semiconservativa de la replicación del ADN, también se descubrió que la replicación del ADN se producía a partir de un punto concreto. Aunque en aquel momento, se dedujo erróneamente que la replicación era unidireccional, después se ha comprobado que es bidireccional, habiendo una horquilla a la izquierda del punto de inicio y otra horquilla a la derecha, que van progresando en direcciones opuestas.

By César Benito Jiménez [CC BY-SA 2.5 es or CC BY-SA 2.5 es], via Wikimedia Commons

Pero este hecho planteó dos dilemas:

¿Cómo podía sintetizar la ADN-polimerasa sin necesidad de un cebador?

¿Cómo podían crecer en paralelo las dos nuevas cadenas? Si una cadena crecía en dirección 5'→3', la otra lo tendría que hacerlo en dirección 3'→5', lo que es imposible de explicar, ya que ninguna ADN-polimerasa añade nucleótidos en esa dirección.

La respuesta a estos dilemas la dio Okazaki en 1968. Descubrió que había unos fragmentos formados por unos 50 nucleótidos de ARN y unos 1000 ó 2000 nucleótidos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki. Estaban sintetizados por la ARN-polimerasa, que no necesita ningún cebador para comenzar, y luego por la ADN-polimerasa, que añadía los nucleótidos en dirección 5'→3' sobre la hebra patrón. Después se pierde el trozo de ARN y se fusionan el resto de fragmentos, dando la sensación de que hebra crece en dirección 3'→5'. Es como puede suceder en la cola de entrada de un espectáculo, que aunque la gente anda hacia adelante, la cola crece hacia atrás.

 

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