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12.4.2. PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa)

La clonación del ADN en las células, principalmente bacterias, es el mejor método para obtener grandes cantidades de un determinado gen o de una secuencia de ADN, pero si la muestra de ADN es muy pequeña, como la de una gota de sangre, no se puede utilizar. En esos casos, se utiliza la técnica llamada PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite amplificar un fragmento específico de ADN de forma exponencial. Esto significa que, a partir de una pequeña cantidad de ADN, se pueden obtener millones o miles de millones de copias del mismo fragmento en un tiempo relativamente corto. 

La PCR se basa en la capacidad de la ADN polimerasa de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de un molde. En la PCR, se utilizan dos cebadores, que son fragmentos de ADN cortos que se unen a las dos extremidades del fragmento de ADN que se desea amplificar. La ADN polimerasa se une a los cebadores y comienza a sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de ellos.

Proceso de amplificación de ADN mediante la PCR

Para poder realizar la PCR son necesarios varios componentes:

  • Una muestra de ADN que se quiere amplificar.
  • Cebador, fragmento de ADN que se une a los dos extremos del fragmento de ADN que se desea amplificar.
  • Una fuente de calor.
  • ADN Polimerasa (taq polimerasa) resistente al calor.
  • Nucleótidos para formar las nuevas cadenas de ADN.

La PCR se lleva a cabo en un termociclador, que alterna entre tres temperaturas:

Termociclador o máquina de PCR

Juan Carlos Fonseca Mata, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons

  • Desnaturalización del ADN: La reacción comienza con la desnaturalización del ADN de la muestra, separando las dos hebras complementarias. Se consigue calentando la muestra a una temperatura elevada, entre 95-98 °C.
  • Hibridación: La temperatura se reduce a 50-65 °C para que los cebadores (secuencias cortas de ADN diseñadas para unirse específicamente a las secuencias de interés) se unan mediante enlaces de hidrógeno a cada uno de los extremos de las cadenas de ADN que se han separado. Los cebadores actúan como iniciadores para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
  • Extensión de la cadena: La temperatura se eleva a 72-75 °C para que se active la ADN polimerasa (Taq-polimerasa) y sintetice nuevas cadenas complementarias de ADN, agregando nucleótidos en el extremo 3' del cebador.
  • Ciclos de Amplificación: Estos tres pasos se repiten en ciclos, multiplicando exponencialmente la cantidad de ADN objetivo. Es decir, en un primer ciclo se obtienen dos moléculas de ADN, que tras un segundo ciclo, se habrán obtenido cuatro moléculas, y tras un tercero, ocho, y así sucesivamente, hasta conseguir el número de moléculas de ADN necesario. Cada ciclo dura unos cinco minutos y solo hacen falta 20 ciclos para obtener una cantidad de ADN que pueda ser útil.

Ciclos de ampliciación de PCR

--Ygonaar 23:09, 7 March 2006 (UTC), CC BY-SA 3.0, via Wikimedia Commons

Calculadora del número de moléculas de ADN obtenidas por PCR

Interpretación de resultados

Los resultados de la PCR se pueden interpretar mediante electroforesis. La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas de ADN en función de su tamaño.

En la electroforesis, las moléculas de ADN se introducen en un gel y se aplica una corriente eléctrica. Los fragmentos de ADN se separan según su tamaño en un gel y se observan mediante un marcador de peso molecular. Las moléculas de ADN más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas de ADN más grandes. Este marcador proporciona una referencia para determinar los tamaños de los fragmentos amplificados, facilitando la identificación de la presencia o ausencia de secuencias específicas.

El fragmento de ADN amplificado por PCR se puede visualizar en el gel mediante una tinción fluorescente. La intensidad de la fluorescencia indica la cantidad de ADN amplificado.

Resultado negativo de PCR

En un resultado negativo de PCR, no se detecta el fragmento de ADN amplificado. Esto puede significar que el ADN del patógeno no está presente en la muestra o que la cantidad de ADN es demasiado pequeña para ser detectada.

Resultado positivo de PCR

En un resultado positivo de PCR, se detecta el fragmento de ADN amplificado. Esto significa que el ADN del patógeno está presente en la muestra. La intensidad de la fluorescencia indica la cantidad de ADN amplificado.

Valores de referencia

Los valores de referencia para la interpretación de los resultados de la PCR varían en función del patógeno y de la aplicación. En general, un resultado negativo se considera negativo si no se observa ninguna banda fluorescente en el gel de electroforesis. Un resultado positivo se considera positivo si se observa una banda fluorescente de intensidad igual o superior a una banda de referencia.

Factores que pueden afectar a los resultados de la PCR

Los resultados de la PCR pueden verse afectados por una serie de factores, como:

  • La calidad de la muestra: La muestra debe ser de buena calidad y contener suficiente ADN del patógeno para ser detectada.
  • La concentración de los reactivos: La concentración de los reactivos debe ser la adecuada para garantizar una amplificación eficaz del ADN.
  • Las condiciones de la PCR: Las condiciones de la PCR, como la temperatura y el tiempo de incubación, deben ser las adecuadas para garantizar una amplificación eficaz del ADN.


Conceptos clave relacionados con la PCR 

Cebadores (primer o sonda):

Los cebadores son pequeños fragmentos de ADN (generalmente de 18 a 25 nucleótidos) diseñados específicamente para emparejarse con secuencias específicas en el ADN que se desea amplificar. Actúan como punto de partida para la síntesis de nuevas cadenas de ADN durante la PCR.

Los cebadores están diseñados para que sean complementarios a una secuencia específica de ADN de la muestra. Cuando se calienta la muestra, el ADN se desnaturaliza, lo que significa que las dos hebras se separan. Los cebadores se unen a las hebras separadas del ADN en su secuencia complementaria. Una vez que los cebadores están unidos, la ADN polimerasa puede comenzar a replicar el ADN, agregando nucleótidos a las hebras separadas.

Hibridación de ácidos nucleicos:

La hibridación es el proceso mediante el cual dos cadenas de ácidos nucleicos (como el ADN) se unen entre sí mediante el emparejamiento preciso de sus bases complementarias (adenina con timina, y citosina con guanina). En el caso de la PCR, los cebadores se unen a la cadena de ADN molde según su secuencia complementaria.

ADN Polimerasa (Taq polimerasa):

La ADN polimerasa es una enzima esencial que cataliza la reacción de replicación del ADN. La ADN polimerasa Taq es una enzima termoestable que se deriva de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus. La ADN polimerasa Taq se utiliza en la PCR porque es capaz de soportar las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar el ADN.

La Taq polimerasa agrega nucleótidos para construir nuevas cadenas de ADN basándose en la secuencia del ADN molde.

Desnaturalización del ADN:

La desnaturalización del ADN es el proceso por el que las dos hebras de ADN se separan. Se produce cuando se calienta el ADN por encima de una temperatura determinada.

La desnaturalización del ADN es necesaria al inicio de cada ciclo de PCR para que los cebadores puedan unirse al ADN molde.

Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis

La electroforesis es una técnica que utiliza un campo eléctrico para mover fragmentos de ADN a través de un gel poroso. La carga eléctrica y la resistencia del gel permiten la separación de los fragmentos según su tamaño. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. Esta técnica se utiliza para analizar y visualizar los resultados de la PCR.

Electroforesis

Tomada de Electroforesis. (n.d.). Retrieved from https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis 

Marcador de peso molecular

Un marcador de peso molecular es una muestra de ADN conocida de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Los marcadores de peso molecular se utilizan para calibrar la electroforesis de ADN. Al comparar el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados con los fragmentos de ADN del marcador, se puede determinar el tamaño de los fragmentos amplificados.

Aplicaciones de la PCR

Algunas de las principales aplicaciones de la PCR son las siguientes:

  • Amplificación de ADN: La principal aplicación de la PCR es la amplificación de secuencias específicas de ADN. Esta técnica permite obtener grandes cantidades de material genético a partir de pequeñas cantidades iniciales de ADN, facilitando su análisis.

  • Diagnóstico genético: La PCR se utiliza para el diagnóstico de enfermedades genéticas al detectar la presencia de mutaciones en genes específicos. Puede ser utilizada para confirmar la presencia o ausencia de genes asociados con enfermedades hereditarias, como la fibrosis quística o la enfermedad de Huntington. También se puede realizar un estudio del ADN de células embrionarias para realizar un diagnóstico genético prenatal.

  • Identificación de patógenos: La PCR es una herramienta esencial en microbiología para la identificación de patógenos, como bacterias, virus y hongos. Se pueden diseñar cebadores específicos para amplificar regiones genómicas únicas de microorganismos, permitiendo su detección.

  • Perfil genético y huellas genéticas: La PCR se utiliza en la elaboración de perfiles genéticos para la identificación de individuos. Se amplifican regiones específicas del ADN, como las utilizadas en las pruebas de ADN para la identificación forense. La PCR se utiliza en medicina forense para identificar personas, determinar la causa de la muerte o reconstruir escenas del crimen. La PCR se puede utilizar para analizar muestras de ADN de sangre, saliva, semen o cabello.

  • Secuenciación de ADN: La PCR es una parte esencial de muchos protocolos de secuenciación de ADN. Amplificar regiones específicas antes de la secuenciación facilita el análisis de fragmentos de ADN.

  • Clonación de ADN: La PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que pueden luego ser insertados en un vector, como un plásmido bacteriano, para su clonación en células hospedadoras. 

  • Estudios de expresión genética: La PCR se utiliza para cuantificar la expresión de genes específicos en una célula o tejido. Permite medir los niveles de ARN mensajero y estudiar cómo se regulan los genes en diferentes condiciones. 

  • Análisis de variabilidad genética: La PCR se emplea para estudiar la variabilidad genética dentro de una población, como en estudios de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o análisis de haplotipos.

  • Ingeniería genética: La PCR es esencial en técnicas de ingeniería genética, como la mutagénesis dirigida para introducir cambios específicos en secuencias de ADN.

  • Estudios de evolución molecular: La PCR se utiliza en estudios evolutivos para analizar cambios en secuencias genéticas a lo largo del tiempo, proporcionando información sobre la evolución de especies. La PCR se utiliza para comparar secuencias de ADN de diferentes especies para comprender la evolución. Por ejemplo, se ha amplificado ADN de un mamut lanudo congelado que vivió hace 40000 años para compararlo con organismos actuales.

Mamut lanudo, elefante lanudo o mamut de la tundra (Mammuthus primigenius)

rpongsaj.Gh5046 at en.wikipedia, CC BY 2.0, via Wikimedia Commons

  • Arqueología: la PCR se utiliza para analizar ADN de restos humanos o animales antiguos para aprender sobre la historia humana. Se puede estudiar el ADN de mominas de civilizaciones antiguas y estudiar las posibles enfermedades genéticas.

  • Agricultura: la PCR se utiliza para detectar la presencia de genes modificados genéticamente (OMG) en alimentos.

  • Medio ambiente: la PCR se utiliza para detectar la presencia de contaminantes ambientales, como pesticidas o metales pesados.

Pregunta de Elección Múltiple

Pregunta

¿Cuál es el propósito principal de la PCR?

Respuestas

Clonar genes en bacterias.

Amplificar fragmentos específicos de ADN.

Separar moléculas de ADN por electroforesis.

Identificar patógenos en muestras.

Retroalimentación

Pregunta

¿Qué función cumplen los cebadores en la PCR?

Respuestas

Actúan como marcadores de peso molecular.

Catalizan la replicación del ADN.

Se unen a las hebras de ADN para iniciar la síntesis.

Detectan la presencia de contaminantes ambientales.

Retroalimentación

Pregunta

¿Cuál es la función de la ADN polimerasa Taq en la PCR?

Respuestas

Separar las cadenas de ADN complementarias.

Sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de los cebadores.

Actuar como marcador de peso molecular.

Detectar la presencia de patógenos.

Retroalimentación

Pregunta

¿En qué consiste la hibridación en el contexto de la PCR?

Respuestas

Separación de hebras complementarias de ADN.

Síntesis de nuevas cadenas de ADN.

Unión específica de los cebadores al ADN molde.

Identificación de fragmentos amplificados por electroforesis.

Retroalimentación

Pregunta

¿Qué se observa en un resultado positivo de PCR?

Respuestas

No se detecta el fragmento de ADN amplificado.

Se detecta el fragmento de ADN amplificado.

La muestra no contiene ADN.

Los cebadores no se unen al ADN molde.

Retroalimentación

Pregunta

¿Cuál es la función de la electroforesis en la interpretación de resultados de PCR?

Respuestas

Amplificar el ADN.

Separar moléculas de ADN por tamaño.

Unir los cebadores al ADN molde.

Iniciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN.

Retroalimentación

Creado con eXeLearning (Ventana nueva)