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12.4.1.2. PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa)

La clonación del ADN en las células, principalmente bacterias, es el mejor método para obtener grandes cantidades de un determinado gen o de una secuencia de ADN, pero si la muestra de ADN es muy pequeña, como la de una gota de sangre, no se puede utilizar. En esos casos, se utiliza la técnica llamada PCR.

El objetivo de la PCR es amplificar un segmento específico de ADN generando de miles a millones de copias a partir de una pequeña cantidad de material genético.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite amplificar un fragmento específico de ADN de forma exponencial. Esto significa que, a partir de una pequeña cantidad de ADN, se pueden obtener millones o miles de millones de copias del mismo fragmento en un tiempo relativamente corto. 

La PCR se basa en la capacidad de la ADN polimerasa de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de un molde. En la PCR, se utilizan dos cebadores, que son fragmentos de ADN cortos que se unen a las dos extremidades del fragmento de ADN que se desea amplificar. La ADN polimerasa se une a los cebadores y comienza a sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de ellos.

Proceso de amplificación de ADN mediante la PCR

Para poder realizar la PCR son necesarios varios componentes:

  • Una muestra de ADN que se quiere amplificar.
  • Cebador (primer o sonda), fragmento de ADN (generalmente de 18 a 25 nucleótidos) diseñado específicamente para unirse a los dos extremos del fragmento de ADN que se desea amplificar. Actúan como punto de partida para la síntesis de nuevas cadenas de ADN durante la PCR.

    Los cebadores están diseñados para que sean complementarios a una secuencia específica de ADN de la muestra. Cuando se calienta la muestra, el ADN se desnaturaliza, lo que significa que las dos hebras se separan. Los cebadores se unen a las hebras separadas del ADN en su secuencia complementaria. Una vez que los cebadores están unidos, la ADN polimerasa puede comenzar a replicar el ADN, agregando nucleótidos a las hebras separadas.

  • Una fuente de calor.
  • ADN Polimerasa (taq polimerasa) resistente al calor. La ADN polimerasa es una enzima que cataliza la reacción de replicación del ADN. La ADN polimerasa Taq es una enzima termoestable que se deriva de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus. La ADN polimerasa Taq se utiliza en la PCR por su estabilidad térmica, ya que es capaz de soportar las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar el ADN sin desnaturalizarse ella misma. Esto permite que no sea necesario añadirla de nuevo en cada ciclo.

    La Taq polimerasa agrega nucleótidos a los cebadores para construir nuevas cadenas de ADN basándose en la secuencia del ADN molde a la que están unidos, extendiendo así las hebras y duplicando la región de interés.

  • Nucleótidos para formar las nuevas cadenas de ADN.

La PCR se lleva a cabo en un termociclador, que alterna entre tres temperaturas:

Termociclador o máquina de PCR

Juan Carlos Fonseca Mata, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons

  • Desnaturalización del ADN: La reacción comienza con la desnaturalización del ADN de la muestra, proceso por el que las dos hebras de ADN se separan en dos hebras individuales al romper los puentes de hidrógeno que mantenían unidas a las bases nitrogenadas complementarias. Se consigue calentando la muestra a una temperatura elevada, entre 90-100 °C. La desnaturalización del ADN es necesaria al inicio de cada ciclo de PCR para que los cebadores puedan unirse al ADN molde.
  • Hibridación (alineamiento o annealing): La temperatura se reduce a 50-65 °C para que los cebadores (primers, secuencias cortas de ADN diseñadas para ser complementarias y unirse específicamente a las regiones objetivo del ADN) se unan o hibriden mediante enlaces de hidrógeno a cada uno de los extremos del segmento a amplificar de las cadenas de ADN que se han separado. Los cebadores actúan como iniciadores para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
  • Extensión de la cadena: La temperatura se eleva a 72-75 °C para que se active la ADN polimerasa (Taq-polimerasa) y sintetice nuevas cadenas complementarias de ADN, agregando nucleótidos en el extremo 3' del cebador.

Ciclos de Amplificación: Estos tres pasos se repiten en ciclos, multiplicando exponencialmente la cantidad de ADN objetivo. Es decir, en un primer ciclo se obtienen dos moléculas de ADN, que tras un segundo ciclo, se habrán obtenido cuatro moléculas, y tras un tercero, ocho, y así sucesivamente, hasta conseguir el número de moléculas de ADN necesario. Cada ciclo dura unos cinco minutos y solo hacen falta 20 ciclos para obtener una cantidad de ADN que pueda ser útil.

Ciclos de ampliciación de PCR

--Ygonaar 23:09, 7 March 2006 (UTC), CC BY-SA 3.0, via Wikimedia Commons

Calculadora del número de moléculas de ADN obtenidas por PCR

Interpretación de resultados

Los resultados de la PCR se pueden interpretar mediante electroforesis. La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas de ADN en función de su tamaño.

En la electroforesis, las moléculas de ADN se introducen en un gel y se aplica una corriente eléctrica. Los fragmentos de ADN se separan según su tamaño en un gel y se observan mediante un marcador de peso molecular. Las moléculas de ADN más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas de ADN más grandes. Este marcador proporciona una referencia para determinar los tamaños de los fragmentos amplificados, facilitando la identificación de la presencia o ausencia de secuencias específicas.

El fragmento de ADN amplificado por PCR se puede visualizar en el gel mediante una tinción fluorescente. La intensidad de la fluorescencia indica la cantidad de ADN amplificado.

Resultado negativo de PCR

En un resultado negativo de PCR, no se detecta el fragmento de ADN amplificado. Esto puede significar que el ADN del patógeno no está presente en la muestra o que la cantidad de ADN es demasiado pequeña para ser detectada.

Resultado positivo de PCR

En un resultado positivo de PCR, se detecta el fragmento de ADN amplificado. Esto significa que el ADN del patógeno está presente en la muestra. La intensidad de la fluorescencia indica la cantidad de ADN amplificado.

Valores de referencia

Los valores de referencia para la interpretación de los resultados de la PCR varían en función del patógeno y de la aplicación. En general, un resultado negativo se considera negativo si no se observa ninguna banda fluorescente en el gel de electroforesis. Un resultado positivo se considera positivo si se observa una banda fluorescente de intensidad igual o superior a una banda de referencia.

La electroforesis es una técnica que utiliza un campo eléctrico para mover fragmentos de ADN a través de un gel poroso. La carga eléctrica y la resistencia del gel permiten la separación de los fragmentos según su tamaño. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. Esta técnica se utiliza para analizar y visualizar los resultados de la PCR.

Electroforesis

Tomada de Electroforesis. (n.d.). Retrieved from https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis 

Marcador de peso molecular

Un marcador de peso molecular, también conocido como estándar de tamaño, es una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños conocidos utilizada en la electroforesis en gel. Su función principal es estimar el tamaño de las moléculas de ADN presentes en una muestra obtenida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Durante el proceso de electroforesis en gel, el marcador de peso molecular se coloca en un pozo de gel, junto a otros pozos donde se coloca con la muestra de ADN. A medida que se aplica una corriente eléctrica, los fragmentos de ADN migran a través del gel según su tamaño, con los fragmentos más pequeños avanzando más lejos que los más grandes. Las bandas del marcador, que corresponden a fragmentos de ADN de tamaños específicos, actúan como referencia. Al comparar las bandas de la muestra con las del marcador, se puede determinar con precisión la longitud de los fragmentos de ADN amplificados en la PCR.

Esta información es útil para verificar si la amplificación de ADN ha sido exitosa y si los fragmentos obtenidos tienen el tamaño esperado.

Factores que pueden afectar a los resultados de la PCR

Los resultados de la PCR pueden verse afectados por una serie de factores, como:

  • La calidad de la muestra: La muestra debe ser de buena calidad y contener suficiente ADN del patógeno para ser detectada.
  • La concentración de los reactivos: La concentración de los reactivos debe ser la adecuada para garantizar una amplificación eficaz del ADN.
  • Las condiciones de la PCR: Las condiciones de la PCR, como la temperatura y el tiempo de incubación, deben ser las adecuadas para garantizar una amplificación eficaz del ADN.

Aplicaciones de la PCR

Algunas de las principales aplicaciones de la PCR son las siguientes:

  • Amplificación de ADN: La principal aplicación de la PCR es la amplificación de secuencias específicas de ADN. Esta técnica permite obtener grandes cantidades de material genético a partir de pequeñas cantidades iniciales de ADN, facilitando su análisis.
  • Diagnóstico de enfermedadesLa PCR se usa para detectar la presencia de patógenos (como bacterias, virus y hongos, etc.) en el cuerpo. Por ejemplo, se ha utilizado mucho para detectar el virus del COVID-19. Al amplificar el material genético del virus, la PCR puede determinar si alguien está infectado, incluso si el virus está presente en cantidades muy pequeñas. Se pueden diseñar cebadores específicos para amplificar regiones genómicas únicas de microorganismos, permitiendo su detección.
  • Pruebas de paternidadEn una prueba de paternidad, la PCR se utiliza para comparar el ADN de un niño con el de los posibles padres. Al amplificar y analizar ciertos fragmentos de ADN, se puede determinar si hay coincidencias genéticas, lo que indica la relación biológica entre ellos.
  • Investigación forenseEn la escena de un crimen, a menudo se encuentran pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, en un cabello o en una mancha de sangre o semen). La PCR permite amplificar ese ADN para obtener suficiente material genético que pueda ser analizado y comparado con muestras de posibles sospechosos.
  • Investigación genéticaLos científicos utilizan la PCR para estudiar genes específicos. Por ejemplo, pueden amplificar un gen que causa una enfermedad para estudiarlo más a fondo y entender mejor cómo funciona y cómo podría tratarse.
  • Clonación de genesLa PCR facilita la clonación de genes, lo que significa hacer muchas copias de un gen específico para estudiarlo, modificarlo o insertarlo en otro organismo. Esto es muy útil en biotecnología y en la creación de organismos genéticamente modificados.
  • Detección de mutaciones genéticasLa PCR se usa para identificar mutaciones en genes que pueden causar enfermedades genéticas, como el cáncer. Detectar estas mutaciones puede ayudar en la prevención y en el desarrollo de tratamientos personalizados. Puede ser utilizada para confirmar la presencia o ausencia de genes asociados con enfermedades hereditarias, como la fibrosis quística o la enfermedad de Huntington. También se puede realizar un estudio del ADN de células embrionarias para realizar un diagnóstico genético prenatal.
  • Secuenciación de ADN: La PCR es una parte esencial de muchos protocolos de secuenciación de ADN. Amplificar regiones específicas antes de la secuenciación facilita el análisis de fragmentos de ADN.
  • Clonación de ADN: La PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que pueden luego ser insertados en un vector, como un plásmido bacteriano, para su clonación en células hospedadoras. 
  • Estudios de expresión genética: La PCR se utiliza para cuantificar la expresión de genes específicos en una célula o tejido. Permite medir los niveles de ARN mensajero y estudiar cómo se regulan los genes en diferentes condiciones. 
  • Análisis de variabilidad genética: La PCR se emplea para estudiar la variabilidad genética dentro de una población, como en estudios de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o análisis de haplotipos.
  • Ingeniería genética: La PCR es esencial en técnicas de ingeniería genética, como la mutagénesis dirigida para introducir cambios específicos en secuencias de ADN.
  • Estudios de evolución molecular: La PCR se utiliza en estudios evolutivos para analizar cambios en secuencias genéticas a lo largo del tiempo, proporcionando información sobre la evolución de especies. La PCR se utiliza para comparar secuencias de ADN de diferentes especies para comprender la evolución. Por ejemplo, se ha amplificado ADN de un mamut lanudo congelado que vivió hace 40000 años para compararlo con organismos actuales.

Mamut lanudo, elefante lanudo o mamut de la tundra (Mammuthus primigenius)

rpongsaj.Gh5046 at en.wikipedia, CC BY 2.0, via Wikimedia Commons

  • Arqueología: la PCR se utiliza para analizar ADN de restos humanos o animales antiguos para aprender sobre la historia humana. Se puede estudiar el ADN de momias de civilizaciones antiguas y estudiar las posibles enfermedades genéticas.

  • Agricultura: la PCR se utiliza para detectar la presencia de genes modificados genéticamente (OGM) en alimentos.

  • Medio ambiente: la PCR se utiliza para detectar la presencia de contaminantes ambientales, como pesticidas o metales pesados.

Cuestión de reflexión

Cataluña, Junio de 2024, bloque 1, ejercicio 2.2.

Janna acaba de llegar de Belice y presenta mucha fiebre y malestar. Los médicos sospechan que podría tener alguna enfermedad endémica de ese país tropical, como el dengue.
Para confirmar o descartar si la joven sufre esta enfermedad utilizan una prueba diagnóstica molecular, rápida y eficiente, mediante la ampliación de una pequeña cantidad de ADN. A continuación, responda a las siguientes preguntas: [1 punto]

  • ¿Qué técnica se ha utilizado en la prueba diagnóstica?
  • Antes de utilizar esta técnica se ha hecho uso de una retrotranscriptasa. ¿Qué es y para qué sirve la retrotranscriptasa?
  • El siguiente gráfico corresponde a la prueba diagnóstica de Janna. ¿Es un resultado positivo o negativo? Justifique la respuesta.

  • ¿Por qué esta técnica permite reconocer específicamente el material genético de este virus y, en cambio, no el de cualquier otro ni el de las células del paciente?

Cuestión de reflexión

Cataluña, Junio de 2024, inciencias, ejercicio 3.3.

Para que se dé esta conversión (de histidina a histamina) es necesario que en el alimento estén presentes las bacterias capaces de hacerlo posible. En el caso del atún encontramos bacterias de diferentes géneros, como Morganella sp., Escherichia sp. y Staphylococcus sp. En la industria alimentaria se han desarrollado diferentes técnicas para detectar la presencia de estas bacterias en los alimentos. Una de estas técnicas es la PCR, en la que, a partir de los genes implicados en la conversión, se diseñan cebadores (primers) específicos para detectarlos. [1 punto]

a) Explique cómo la técnica de la PCR permite detectar la presencia de estas bacterias aunque se encuentren en concentraciones muy bajas.
b) ¿Pueden utilizarse los mismos cebadores (primers) para detectar Morganella y Staphylococcus? Justifique la respuesta.

Preguntas que han salido en exámenes de acceso a la Universidad (PAU, Selectividad, EBAU, EvAU)

Aragón, Julio de 2024, pregunta 9

Una de las aplicaciones de la PCR es la determinación de la paternidad entre animales, debido al alto coste económico o productivo que pueden tener algunos individuos. Conteste las siguientes preguntas relacionadas con la PCR: (2 puntos)

a) ¿Qué significa PCR y cuál es su objetivo principal? (0,3 puntos)
b) ¿Cuáles son las fases principales de un ciclo de PCR? Explique brevemente qué ocurre en cada una de ellas, indicando el papel de los elementos que intervienen en cada fase. (1,2 puntos)
c) Explique brevemente por qué es necesario repetir los ciclos en una PCR. (0,5 puntos) 

Aragón, Junio de 2024, pregunta 9

Responda las siguientes preguntas relacionadas con la PCR: (2 puntos)

a) ¿Qué es la fase de desnaturalización en la PCR y a qué temperatura se realiza típicamente? (0,5 puntos)
b) ¿En qué consiste la fase de hibridación (alineamiento o annealing) y por qué es importante la temperatura en esta fase? (0,5 puntos)
c) ¿Qué es la ADN polimerasa (Taq polimerasa)? Cite su función y alguna de sus características que la hacen importante en la PCR. (0,5 puntos)
d) ¿Qué es el marcador de peso molecular? (0,5 puntos)

Murcia, Junio de 2024, pregunta 4.2.

En relación con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

A) Explique brevemente en qué consiste y para qué se utiliza (0,4 puntos).
B) Explique qué procesos tienen lugar en cada ciclo (0,6 puntos).

Canarias, Julio de 2024, pregunta 18

La PCR es una técnica muy potente que se ha vuelto indispensable en cualquier laboratorio de biología molecular, por sus numerosas aplicaciones. Además, es una de las pocas técnicas que han logrado salir del mundo de los laboratorios y convertirse en conocida del gran público.

a. ¿En qué consiste esta técnica molecular?
b. ¿Cuáles son los elementos que deben estar presentes para que se produzca?
c. ¿Cuáles son las fases del proceso?
d. ¿Qué interpretación tiene un resultado positivo o negativo de la PCR?

Repasando alguns conceptos sobre la PCR

Pregunta

¿Cuál es el propósito principal de la PCR?

Respuestas

Clonar genes en bacterias.

Amplificar fragmentos específicos de ADN.

Separar moléculas de ADN por electroforesis.

Identificar patógenos en muestras.

Retroalimentación

Pregunta

¿Qué función cumplen los cebadores en la PCR?

Respuestas

Actúan como marcadores de peso molecular.

Catalizan la replicación del ADN.

Se unen a las hebras de ADN para iniciar la síntesis.

Detectan la presencia de contaminantes ambientales.

Retroalimentación

Pregunta

¿Cuál es la función de la ADN polimerasa Taq en la PCR?

Respuestas

Separar las cadenas de ADN complementarias.

Sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de los cebadores.

Actuar como marcador de peso molecular.

Detectar la presencia de patógenos.

Retroalimentación

Pregunta

¿En qué consiste la hibridación en el contexto de la PCR?

Respuestas

Separación de hebras complementarias de ADN.

Síntesis de nuevas cadenas de ADN.

Unión específica de los cebadores al ADN molde.

Identificación de fragmentos amplificados por electroforesis.

Retroalimentación

Pregunta

¿Qué se observa en un resultado positivo de PCR?

Respuestas

No se detecta el fragmento de ADN amplificado.

Se detecta el fragmento de ADN amplificado.

La muestra no contiene ADN.

Los cebadores no se unen al ADN molde.

Retroalimentación

Pregunta

¿Cuál es la función de la electroforesis en la interpretación de resultados de PCR?

Respuestas

Amplificar el ADN.

Separar moléculas de ADN por tamaño.

Unir los cebadores al ADN molde.

Iniciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN.

Retroalimentación

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